Принцип ПЦР исследования
Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР)? Практически каждый человек в жизни сталкивается с этим методом, даже если не знает об этом. ПЦР исследует генетический материал – ДНК или РНК. Благодаря открытию ПЦР медицина и наука вышли на новый уровень и стала возможной точная диагностика различных инфекций, наследственных и онкологических заболеваний, установление отцовства и даже клонирование генов. ПЦР широко используется в криминалистике, раскопках и других областях, поскольку источником ДНК может быть капля крови, оставленная на месте преступления или человеческий волос, и даже останки мумии или мамонта, пролежавших тысячи, миллионы лет…
Но сегодня нас будет волновать ПЦР как точный метод диагностики инфекционных заболеваний, где он заслуженно удостоен звания «золотой стандарт». В основе метода – поиск ДНК микроорганизмов, то есть точное установление «личности» микроба, ставшего причиной заболевания.
Как работает ПЦР?
Всем известно из курса биологии, что генетический материал всего живого на Земле представлен двухцепочечной молекулой ДНК (кроме некоторых вирусов, содержащих РНК). Каждая цепочка ДНК состоит из комбинации четырех нуклеотидов. Да-да, нуклеотидов всего 4, но из них составлен генетический материал всех живых существ. Разница лишь в определенной последовательности нуклеотидов в цепочках ДНК. Зная уникальный порядок нуклеотидов в участке ДНК искомого микроорганизма, возможно его выявить в любом биологическом материале.
Принцип ПЦР заключается в многократном удвоении (амплификации) участка ДНК при помощи специальных ферментов.
Почему реакция называется полимеразная цепная?
В чём преимущества ПЦР?
Для грамотного применения метода следут запомнить следующие моменты:
ПЦР выявляет ДНК возбудителя независимо от того, живой он или мёртвый, поэтому:
Для выявления ДНК внутриклеточных инфекционных агентов ( например, вирусов) нужны клетки, поэтому:
Слизь, кровь и гной могут заблоктровать реакцию ПЦР, поэтому:
Проведение ПЦР требует строго соблюдения условий технологии, поэтому в лаборатории KDL:
Будьте здоровы и обследуйтесь в лаборатории, которой доверяете!
Что значит обследование на иппп методом пцр
Анализ ПЦР активно применяется для диагностики урогенитальных (так называемых половыми или мочеполовыми инфекциями), в том числе, ЗППП (ИППП) или заболеваний (инфекций), передаваемых половым путем. Эти инфекции встречаются как у мужчин, так и у женщин.
Многие микробы могут вызвать восходящую инфекцию – воспалительные заболевания малого таза (сальпингит, сальпингоофорит или «воспаление придатков матки»). При некоторых условиях воспаление может вызвать банальная микрофлора (после аборта, в послеродовом периоде), но особенно опасны те микроорганизмы, которые могут вызвать восходящую инфекцию без предварительных вмешательств (при снижении иммунитета, обострении хронических заболеваний, стрессах, переутомлении).
Гонококковая инфекция очень распространенная и сложно выявляемая. Характеризуется вялым течением и поражением различных органов. Очень распространенные микроорганизмы группы микоплазм – ureaplasma urealyticum, mycoplasma hominis, mycoplasma genitalium. Эти микроорганизмы являются промежуточными между патогенными и условно-патогенными. Они очень мелкие, без клеточной мембраны, похожи на бактерии, но по современной классификации к ним не относятся. Это мельчайшие микроорганизмы, способные к размножению в питательной среде, нет антибиотиков, которые обладают бактерицидным действием на эти микроорганизмы.
Трихомонады – широко распространены, опасны по восходящей инфекции. В основном вызывают кольпиты, которые могут протекать бессимптомно. Часто являются составляющей ассоциаций, вызывающих воспаление маточных труб.
Вирус простого герпеса – представляет серьезную проблему, так как у некоторых пациентов является рецидивирующей инфекцией, мешает нормальной половой жизни, создает множество психологических проблем. Герпетическая инфекция, по данным литературы, является опасной для новорожденных.
Цитомегаловирус – не является типичной генитальной инфекцией, используется в комплексной диагностике цитомегаловирусной инфекции.
Анаэробные бактерии (бактерии, развивающиеся в отсутствии или при небольшом содержании кислорода) – составляют целую группу инфекций, некоторые из них встречаются в норме. При нарушении баланса между различными видами микроорганизмов могут вызывать упорные воспалительные процессы. Характерно развитие местного воспаления, бели с неприятным запахом (неприятный запах обусловлен выделением анаэробами аминов). Наиболее известные из анаэробов – гарднереллы.
Исследование методом ПЦР актуально для мужчин и для женщин, если:
Не обследовались никогда или обследовались более года назад
Имели незащищенные половые контакты после последнего обследования
Планирование беременности (сдают оба супруга. Внимание! Результаты анализов ПЦР супругов могут различаться. Это связано с возможной разницей течения процесса у каждого из супругов).
Появились какие-либо жалобы, например, неприятные ощущения, зуд, жжение, выделения, запах из влагалища, ощущение раздражения.
Появились какие-либо жалобы, например, неприятные ощущения, зуд, жжение, расстройства мочевыделения, выделения, ощущение раздражения.
Обратите внимание, многие инфекции протекают бессимптомно (так называемые скрытые инфекции), поэтому сдавать анализы ПЦР следует не только при наличии жалоб.
Возбудители инфекций урогенитального тракта (в том числе, инфекции, передаваемые половым путем, венерические заболевания):
Вирусные инфекции, передающиеся половым путем
Инфекции, вызванные простейшими
В ИЛЦ ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в ЯНАО» вы можете произвести комплексное обследование на урогенитальные инфекции методом ПЦР:
3. Флороценоз –аэробы – количественное определение Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Staphulococcus spp.
4.Флороценоз – кандиды – определение условно-патогенных микроорганизмов – грибов Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata.
5.Флороценоз NCMT — определение клинически значимых патогенных возбудителей инфекций, передающихся половым путем. Включает в себя исследование возбудителей: Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium.
6. Количественное и качественное исследование на вирус папилломы человека.
7. Качественное исследование на вирус простого герпеса I и II типов.
8. Количественное исследование на вирус Эпштейн Барра, цитомегаловирус, вирус простого герпеса 6 типа.
Подготовка к анализу:
Для женщин: Сдаются после менструации. В течение 24 часов запрещены половая жизнь, спринцевания, влагалищные души, применение тампонов, свечей и других местных препаратов. Желательно не принимать ванну. Допускается только наружный туалет половых органов.
Для мужчин: Не мочиться в течение 1,5-2 часов.
ПЦР: что это такое?
ВАЖНО!
Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.
Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.
Специфичность и применение
ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).
Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.
Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.
Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.
После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.
Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию
Словарь
Праймер – котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.
Литература
ВАЖНО!
Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.
Лабораторная диагностика инфекций органов репродукции: анализы на урогенитальные инфекции
Урогенитальные инфекции относятся к группе репродуктивно значимых инфекций, и часто становятся причиной бесплодия, нарушения эректильной функции, осложнений беременности и родов, болезней новорожденных, воспалительных заболеваний половых органов.
Развитие клинически выраженного заболевания зависит от состояния иммунной системы, концентрации и вирулентности возбудителя инфекции. Зачастую первые симптомы ИППП появляются уже при развитии осложнений. Кроме того, клинические проявления большинства урогенитальных инфекций неспецифичны. Поэтому, даже при наличии симптомов, не всегда возможно поставить верный диагноз. В этом случае врачу также помогает анализ на урогенитальные инфекции.
Инфекций, передающихся половым путём большое количество, для многих из них половой путь не единственный путь передачи. Некоторые ИППП передаются через кровь, или препараты крови, а также от матери плоду и способны вызывать осложнения беременности и болезни новорожденного.
Инфекции, вызванные безусловно-патогенными микроорганизмами, например, хламидийная, гонококковая, микоплазменная инфекции, требуют обязательного лечения. При несвоевременной диагностике и отсутствии терапии, они способствуют развитию воспалительных заболеваний органов малого таза (ВЗОМТ) у женщин, воспаления яичков и его придатков у мужчин (эпидидимит, орхит). Впоследствии эти осложнения могут стать причиной бесплодия, невынашивания и других осложнений беременности и родов.
Сегодня ИППП занимают ведущее место в структуре инфекционной патологии. Ежедневно более 1 млн. человек заражаются ИППП. По данным Всемирной Организации Здравоохранения распространение урогенитальных инфекций имеет тенденцию к значительному росту.
В числе инфицированных урогенитальными инфекциями может оказаться любой человек, ведущий половую жизнь. И чем чаще происходит смена полового партнера, тем выше риск заражения. При этом всегда надо помнить, что отсутствие неприятных ощущений совсем не означает отсутствие инфекции. Важно периодически проходить лабораторные обследования на урогенитальные инфекции, так как ранний и точный диагноз позволит назначить эффективное лечение и избежать тяжелых осложнений.
Для лабораторной диагностики урогенитальных инфекций используют различные методы и технологии. Основу лабораторной диагностики урогенитальных инфекций составляют методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), из которых в нашей стране наиболее известным является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Анализы на инфекции органов репродукции (урогенитальных инфекций) в CMD
В лаборатории Центра молекулярной диагностики (CMD) доступны лабораторные исследования для выявления генетического материала (ДНК) отдельных возбудителей урогенитальных инфекций методом ПЦР. Анализ доступен как в качественном (выявление ДНК возбудителя), так и количественном (определение концентрации ДНК) форматах.
CMD предлагает тест на основе ПЦР в реальном времени в формате «Мультипрайм», позволяющий одновременно выявить четырех наиболее значимых патогенных возбудителей ИППП (гонореи, хламидиоза, трихомониаза и инфекции, вызванной M. genitalium).
Для выявления и определения концентрации условно-патогенных микоплазм и уреаплазм также разработан количественный ПЦР-тест в формате «Мультипрайм».
Что значит обследование на иппп методом пцр
Интервью с к.б.н., руководителем группы ПЦР инфекционных заболеваний компании «Вега» ГК Алкор Био Виталием Ведерниковым.
К наиболее популярным в лабораторной практике методам тестирования ИППП в настоящее время относятся: культуральный метод, микроскопия в проходящем свете, иммунофлуоресцентный и иммуноферментный анализы, молекулярно-генетические методы, нацеленные на выявление ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) патогенна.
Об особенностях лабораторной диагностики ИППП мы беседуем с к.б.н., руководителем группы ПЦР инфекционных заболеваний компании «Вега» ГК Алкор Био Виталием Ведерниковым.
— Какие из ИППП наиболее распространены и представляют наибольшую опасность для здоровья человека?
— Какие подходы к диагностике ИППП сегодня являются основными? 
— Существуют три основных подхода к диагностике ИППП. Это культуральный метод, бактериоскопия мазка с иммунофлуоресцентным мечением или без и тестирование с использованием методов амплификации нуклеиновых кислот, в том числе ПЦР в режиме реального времени. А вообще методов диагностики ИППП множество, но ни один из них не является идеальным. К примеру, ранее «золотым стандартом» считался культуральный метод (выращивание патогена на культуре, посев), но, как показала практика, и его следует использовать не в отдельности, а в сочетании с другими методами диагностики. К тому же метод, признанный «золотым стандартом» для диагностики одной инфекции, может совершенно не подходить для диагностики другой инфекции.
— Расскажите подробнее о современных подходах к комплексной диагностике ИППП
— Рассмотрим в данном ключе три безусловных патогена: гонорею, трихомонаду и хламидию.
Начнем с гонореи. Рекомендуемый алгоритм обследования на гонорею в России и за рубежом практически не отличается. Общепризнанно, что оптимальным является проведение бактериоскопии (то есть после окрашивания препарат исследуют под микроскопом) с окраской по Граму в сочетании с культуральным методом. Такая комбинация методов обеспечивает высокие показатели чувствительности и специфичности. Специфичность бактериоскопического исследования достигает 96-99%, это связано с тем, что данная бактерия имеет четкую морфологическую форму (в виде кофейного зерна), поэтому под микроскопом ее можно довольно точно определить.
Наиболее оправданным на сегодня показанием для применения ПЦР в целях диагностики гонореи следует считать наличие клинико-анамнестических данных в пользу бессимптомного протекания инфекции.
Иммунологические анализы для диагностики гонореи практически не используются и, вероятнее всего, не будут активно внедряться.
Ложноотрицательные результаты микроскопического исследования на влагалищные трихомонады неизбежны при безупречном проведении анализа, поскольку чувствительность этого метода даже в вагинальных препаратах составляет 40-80%, а в цервикальных мазках это простейшее обнаруживается у 60% пациенток с трихомониазом.
Проблема ложноположительных результатов наиболее часто применяемого в России микроскопического исследования на трихомонады с использованием окрашенных препаратов не менее актуальна, поскольку существуют объективные причины для гипердиагностики данного представителя простейших. Влагалищные трихомонады могут быть весьма вариабельны по размеру и форме, что нередко побуждает исследователя искать так называемые «атипичные формы», за которые могут быть приняты клеточные элементы, которые в процессе приготовления мазка в ряде случаев приобретают необычные морфологические характеристики. Таким образом, для повышения эффективности микроскопической диагностики следует учитывать трихомонады с характерной морфологией и/или характерной подвижностью. Любая же атипия является не дополнительным резервом эффективной диагностики, а реальным источником диагностических ошибок.
Исследование гуморального ответа при трихомониазе, как и при гонорее, в диагностических целях не регламентировано.
— Какова в целом роль ПЦР в диагностике ИППП?
Для диагностики микоплазмы гениталиум и вируса паппиломы человека ПЦР анализ считается единственным адекватным методом, так как другими методами эта инфекция выявляется крайне плохо. Это связано с тем, что морфологически микоплазму практически невозможно отличить от других бактерий, на культурах она растет очень плохо.
ПЦР метод позволяет диагностировать латентную стадию инфекции, малосимптомные и бессимптомные варианты, когда не наблюдается воспалительный процесс. Особенно это касается урогенитального хламидиоза (УГХ): метод выделения этого возбудителя на культуре клеток, бывший до недавнего времени «золотым стандартом» диагностики УГХ, как уже упоминалось, имеет чувствительность 60-90% и уступает ПЦР по этому показателю. А в целом, цифры таковы: хламидиоз бессимптомно протекает почти у 80% зараженных этим возбудителем мужчин и у 50% женщин; присутствие трихомониаза не ощущают большинство мужчин и более 10% женщин, гонорея бессимптомно протекает у 10% мужчин и более 50% женщин.
Могут встретиться и новые изоляты ИППП, которые ранее не встречались, то есть патогены с мутациями и тогда есть вероятность, что метод ПЦР не сработает.
А в целом, практически любой положительный и, подчеркиваю, отрицательный результат, полученный при диагностике ИППП каким-то одним методом, необходимо проверять другим методом или методами. Выбор же методов диагностики зависит от возможностей лаборатории и квалификации специалистов.
